糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,HbA1c)是葡萄糖与血红蛋白β珠蛋白链末端缬氨酸残基结合生成的稳定化合物,在糖尿病筛查、诊断及疗效监测中起重要作用。卫生部临检中心室间质评回报显示(www.clinet.com.cn),2018年总共1 784家实验室,按照方法学排序依次为离子交换高效液相色谱法1 284家(71.8%),免疫比浊法247家(13.8%),硼酸盐亲和高效液相色谱法122家(6.8%),酶法54家(3.0%),毛细管电泳9家(0.5%),低压液相色谱法7家(0.4%),POCT设备13家(0.7%),其他47家(2.6%)。本文概述离子交换高效液相色谱法、免疫比浊法、硼酸盐亲和高效液相色谱法、酶法及电泳法在其测定中的发展及优缺点。
1.离子交换高效液相色谱法:
其原理为在选定浓度洗脱液的离子强度条件下,由于血红蛋白中各组分所带电荷不同,通过阳离子交换树酯分离。Allen等在1958年首先明确地证明了人类血红蛋白的异质性,当时用阳离子交换柱IRC-50将A1a、A1b和A1c分离。1966年有研究用阳离子交换柱Bio-Rex 70分离了HbA1c,并发现其约占6%。阳离子交换色谱法是较早应用于糖化血红蛋白检测的方法,70年代发展为成熟的高效液相色谱法,之后陆续出现了多个全自动高效液相色谱糖化检测仪。糖尿病控制及并发症试验和英国前瞻性糖尿病研究奠定了此方法结果与糖尿病并发症的相关性,经过近50年的发展,高效液相色谱法已经有非常成熟的技术与多种商业化全自动检测仪,并成为现在实验室应用较宽广的方法。此方法操作方便、结果准确、快速,缺点是易受到异常血红蛋白干扰,随着检测技术改进与提高,很多厂家为了应对异常血红蛋白的干扰,推出了糖化血红蛋白检测的变异模式,减少异常血红蛋白的干扰。
2.硼酸盐亲和高效液相色谱法:
其原理为使用硼酸亲和层析凝胶柱,硼酸具有与糖基化血红蛋白分子的顺位二醇基可逆结合反应的性质,致使糖基化血红蛋白选择性地结合于柱上,而非糖化血红蛋白被洗脱而分离测定。硼酸亲和层析法在80年代就有报道,具有高效的分离和定量糖基化血红蛋白的能力,并显示硼酸亲和方法与阳离子交换树脂小柱法和比色法相关性良好。由于此方法检测总糖基化血红蛋白,所以HbA1c结果为计算结果。硼酸亲和层析法由于受到异常血红蛋白的干扰较小,在既往研究中通常被用作参比方法。
3.免疫法:
20世纪80年代开始制备HbA1c单克隆抗体并应用于HbA1c的检测,90年代开始出现免疫法的商业试剂盒。现代的免疫法所用抗体大部分以血红蛋白链糖基末端的4个氨基酸残基作为抗体识别位点,操作简单、方便、快速,能够避免大部分异常血红蛋白干扰,但是免疫法不能识别异常血红蛋白。2018卫生部临检中心数据显示,免疫法和酶法CV高于离子交换高效液相色谱法。
4.酶法:
21世纪开始有报道酶法检测HbA1c。酶法测定HbA1c的基本原理为全血样本用溶血剂处理后,其中的血红蛋白与试剂中的蛋白酶反应,切断血红蛋白的β链N末端的糖化二肽,生成的糖化氨基酸片段在果糖氨基酸氧化酶的催化下生成H2O2,通过与色原反应在700 nm吸光度变化而得出HbA1c浓度。酶法检测原理存在局限性,单试剂检测试剂盒只能适用于一定的血红蛋白浓度范围。酶法在实验室应用较少,此方法也不能识别异常血红蛋白。
5.电泳法:
较早应用于HbA1c检测的电泳法可追溯到1965年,有学者用汞基苯甲酸盐对血红蛋白进行前处理,淀粉凝胶电泳发现有一条快速带HbA1c。1968年Rahbar用氯汞基苯甲酸盐处理过的淀粉电泳(巴比妥缓冲液pH.8.6)时发现,在糖尿病患者溶血液中,存在一个快速移动的条带,从真正意义上发现了HbA1c与糖尿病的相关性。Rahbar等对糖尿病患者血液中的这种异常血红蛋白用电泳法做了进一步的研究,并证明了这种血红蛋白即为HbA1c。70年代开始用等电聚焦电泳来检测HbA1c,这一技术相较于当时的阳离子交换色谱法来说,简单省时,且条带分离更清晰,还能够分离血红蛋白变异体,分辨率更高。80年代改进的测定HbA1c的电泳方法,用自动扫描密度法测定HbA1c总量,重现性好,与高效液相色谱法有良好的相关性,还能分辨血红蛋白S和C及其糖基化变异组分,使HbA1c的定量更加准确。20世纪90年代出现了商业化的琼脂糖电泳法试剂。
随着糖化血红蛋白标准化程度的提高,琼脂糖电泳结果的精度以及检测通量不能完全满足实验室和临床要求,不适用于HbA1c的大批量检测。90年代出现了商业化的毛细管电泳HbA1c检测系统,具有快速,精密度高,敏感性高等特点,是临床实验室测定HbA1c的一种有价值的分析工具。毛细管电泳法不受大部分异常血红蛋白的干扰,可用于异常血红蛋白的定量和定性分析。2012年首先报道了全自动毛细管电泳仪检测HbA1c的性能评价,此技术实现了毛细管电泳检测HbA1c的标准化与高通量,各项性能指标完全满足实验室和临床要求。近年来,毛细管电泳技术不断发展,用于检测的各项性能指标也不断提升,特别是管间差、检测速度和精密度等指标。
